新冠病毒SARS-CoV-2主蛋白酶M^pro负责病毒蛋白链的切割，并促进病毒的组装。因此，M^pro是抗病毒药物研发的关键靶点。目前对靶向SARS-CoV-2M^pro的药物开发研究，主要集中在其底物结合口袋中的S4-S1’位点（例如，辉瑞公司开发的抗新冠药物Paxlovid^TM），而对其S1’-S3’位点的底物结合选择性以及抗病毒抑制剂开发研究较少，特别是S1’-S3’位点本身是否可以用于抗病毒抑制剂开发还不清楚。

图1.靶向S1’-S3’口袋的新型SARS-CoV-2M^pro抑制剂的开发

近日，北京大学深圳研究生院/省部共建肿瘤化学基因组学国家重点实验室/深圳湾实验室黄昊团队及许正双副教授，联合深圳市第三人民医院/国家感染性疾病临床医学研究中心张国良团队开发了靶向S1’-S3’位点的新型SARS-CoV-2M^pro共价抑制剂（图1）。该项研究通过合理设计多肽，利用等温滴定量热法(ITC)方法，探究了SARS-CoV-2M^pro S1’-S3’位点的底物选择性，其中S1’位点偏好Ala，S2’偏好Lys/Ile，S3’偏好Phe/Trp。作者通过解析多肽/M^pro的晶体结构揭示其底物选择性的分子机制（图2）。结构分析表明，S1’-S3’口袋可以选择性地结合病毒多肽底物，并发现M^pro的S1’-S3’口袋对多肽序列Ala-Ile-Phe （AIF）有较高的亲和力。

图2.SARS-CoV-2M^pro S1’-S3’口袋的底物选择性及多肽/M^pro蛋白晶体结构

接下来，作者以多肽序列Ala-Ile-Phe (AIF)序列作为新抑制剂的骨架，在Ala的N-末端引入共价接头。通过测试不同的共价接头发现，含α-卤代乙酰胺型共价接头的化合物对SARS-CoV-2 M^pro具有抑制活性，其中以AIF为骨架，并含溴代乙酰胺共价接头的化合物D-4-38有较好的抑制活性。随后，作者以D-4-38为基础，探究了P3’位置的构效关系。作者解析了Phe（P3’）临位-羟基取代衍生物D-5-96/M^pro的晶体结构，确认了抑制剂与M^pro结合模式。通过优化，最终获得了抑制活性最好的Phe（P3’）临位和对位-甲基双取代化合物D-4-77（IC₅₀ = 0.95 μM，抗病毒EC₅₀ = 0.49 μM）（图3）。

因为M^pro还对宿主细胞的NF-κB先天免疫有抑制作用。作者发现D-4-77能通过抑制M^pro进而恢复宿主NF-κB免疫反应，因此D-4-77除了抑制M^pro对病毒多肽链的剪切，还是对抗SARS-CoV-2导致人体先天免疫反应损伤的的免疫保护剂。

图3.SARS-CoV-2M^pro抑制剂优化及抑制剂与M^pro结合模式

综上，该项工作探究了SARS-CoV-2 M^pro S1’-S3’口袋的底物选择性，并通过合理设计，开发靶向S1’-S3’口袋的新型共价抑制剂。该研究证明了SARS-CoV-2 M^pro的S1’-S3’口袋可成药性，为M^pro抑制剂开发提供了新骨架和新策略。

北京大学博士研究生刘明、助理研究员李吉辉博士、深圳市第三人民医院刘文齐博士（张国良团队）、北京大学博士研究生杨颖为该工作共同第一作者。为本文做出贡献的还有北京大学张曼曼、朱雯宁，叶宇鑫博士、清华大学蛋白质研究技术中心周翠燕博士、北京大学翟宏斌教授。该工作得到国家自然科学基金、深圳市科技项目等基金的大力支持。

论文信息：

The S1’-S3’ Pocket of the SARS-CoV-2 Main Protease Is Critical for Substrate Selectivity and Can Be Targeted with Covalent Inhibitors

Ming Liu,^† Jihui Li,^† Wenqi Liu,^† Ying Yang,^† Manman Zhang, Yuxin Ye, Wenning Zhu, Cuiyan Zhou, Hongbin Zhai, Zhengshuang Xu,* Guoliang Zhang,* Hao Huang*

Angewandte Chemie International Edition, DOI: 10.1002/anie.202309657

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202309657